大多数非灵长类哺乳动物的视网膜血管发生在出生后。成年小鼠进行视网膜血管网络系统可以粗略地分析分为3层;位于神经节细胞内通过表面的浅层血管网,位于中国内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网。由于啮齿类动物的视网膜血管系统局限于二维空间，出生后易于监测和操作，易于观察血管网的发生和形成，因此啮齿类动物的视网膜血管系统已成为研究血管发育的较好模型系统。在视网膜病的病理发展过程中,多数导致失明的疾病问题都是学生由于存在异常的眼内血管发生而造成。例如，人类糖尿病视网膜病变、视网膜血管结构改变、视网膜水肿和出血，导致视力受损。因此,了解调制视网膜血管生长的机制可以为阐明病理性血管系统发生发展提供相关理论研究依据。本实验的目的是通过观察啮齿动物视网膜血管发育的基本过程和血视网膜屏障，为进一步研究病理视网膜血管和视网膜疾病中BRBR损伤的细胞分子机制提供依据。
材料和方法
1，实验动物
C57BL/6J小鼠和SD大鼠,雌雄不限,由河南省进行实验研究动物管理中心发展提供。常年室温在22~25℃.相对湿度为60~70%。定期消毒,房间面积5o㎡。按自然昼夜节律采光,自由进食和饮水。仔鼠出生当日计为PO（postmatalday0）。
2．视网膜整体铺片、切片制作及免疫组织化学染色
视网膜铺片采用不同年龄组（P1,P3,P5,P7、P10,P14,P30）的小鼠各12只,切片采用不同年龄组的大鼠各6只。用1％戊巴比妥钠按20mg/kg体重腹腔注射麻醉后,用4％多聚甲醛（paralormaldehyde，PFA，0.1mol/L.PB配置）经左心室进行灌流,取出眼球,剪去眼前节（角膜﹑品状体）,体视显微镜下小心剥离出视网膜。将视网膜组织剪成”+”字花形,放入4％PFA4℃固定2~3h。0°c，在1mol/lpbs(ph7.4)中冲洗3次，每次15min。第一抗体在4℃孵育2～3天。所用一抗分别为兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein.GFAP,1:,北京中杉金桥生物技术有限公司）和兔抗鼠Ⅳ型胶原蛋白（CollagenN,ColN.1:,ABP;Chemicon公司）。0.O1moLLPBS漂洗3次，每次15分钟。二杭AlexFluro标记羊抗兔lgG（1:,Invitrogen公司）4℃孵育培养过夜。0.01mol/LPBS漂洗3次，每次15mmin。将视网膜相关神经节细胞层结构向上平铺在一个干净的载玻片上,滴加封片剂,加盖盖玻片,指甲油封固四周,晾干后在荧光电子显微镜（BX61,Olympus）下观察摄片。制作切片时将固定好的视网膜依次浸泡在10％,20％,30％蔗糖溶液（0.1mol/L.PB配置）脱水下沉，然后把视网膜平铺在干净的幻灯片上，吸收周围的多余的糖溶液，滴胶在视网膜上，放在冷冻切片机的冷桌上迅速冷冻成固体形式，修复成规则型，用冷冻切片机切片，切片厚度为l8pum，切片干燥后组织化学染色，密封。
3.电镜标本的制作
选择6只po.p3、pi4和P30小鼠。腹腔注射1%吡巴比妥钠(20mg/kg)进行全麻。面部开放后，将4%pfa与戊二醛混合液(4:1)注入左心室，清除积液。取出学生眼球,剥离出视网膜,用双面影响刀片进行垂直方向切开患者视网膜成mmx2mm左右的组织块。4％戊二醛浸泡固定2~4h,0.01mol/L.PBS漂洗3次,每次15min。用1%的饿酸浸泡，固定1~2h左右。0.01mol/L.PBS漂洗处理干净。再经不同系列以及丙酮通过梯度发生脱水,Epon浸脂,树脂可以包埋,按37℃（3h）,45℃（6h）和63℃（24h））进行信息聚合,制成组织电镜观察标本。用醋酸过氧化氢釉和柠檬酸铅染色70nm超薄切片，透射电镜观察视网膜各层毛细血管的超微结构。
4．明胶墨汁灌流模型展示自己成年小鼠进行视网膜各层血管网
2至3个月服用12只成年小鼠，并在腹腔内注射1%的皮巴比托钠（20毫克/千克）麻醉。开胸后先用4％PFA经左心室进行灌流至流出的液体逐渐变清,再用60℃的6.5％明胶墨汁灌流至全身组织变黑,然后经小鼠出现心脏通过根部采用结扎,放人-20℃冰盒冻存2h左右。取出眼球,剥离视网膜,剪成”＋”字花形,平铺在干净的载或片上，用0.olmol/LPBS封片,指甲油封固,瞭干后在显微镜下观察视网膜各层血管网并摄片。
结果
光镜下视网膜神经胶质血管系统的发育
1.1啮齿类动物视网膜血管网的发育发展过程:啮齿类动物的视网膜组织血管进行系统是在出生后由视乳头部位可以发出,并以视乳头为中心呈放射状蔓延生长,逐渐成为形成一个浅层血管网并最终实现覆盖企业整个研究视网膜。在此过程中,浅层血管网不断发生修建重型,分化出血管主干.分支、动脉、静脉等。，从连接处的血管芽延伸到人视网膜内核层的内外边缘，形成两个平行于浅层血管网的深层血管网，血管网的发育过程与星形胶质细胞有关。图1显示了光学电子显微镜下啮齿类视网膜进行浅层血管网的发育发展情况。用IV型胶原抗体标记出生后不同年龄段的大鼠视网膜。Pl时,视网膜血管从视乳头中心发出.呈放射状发展不对称以及生长。P3时,血管以视乳头为中心在视网膜内表面进行继续向周边国家蔓延,形成辐射状且相对比较均匀的网状组织结构。PS到P7，血管网络继续向周界扩散，重塑形成非伦理网络：周围血管网络相对多警戒、密密麻麻的结构，而血管网络的中心区域变得相对松散;血管直径有明显差异，区分血管干干和支部，重塑血管干干周围，区分血管主部，运动，静脉存在，动脉干周围出现无血管区域。至PIO时,视网膜浅层血管网系统已经可以到达视网膜边缘,并覆盖企业整个视网膜,且中央部位的浅层血管网建设已经开始发出一种血管芽向深层生长。P10后，视网膜浅表血管网进一步重构，多余的小血管消失，血管网变得松散，血管分支更加分级。至P14时,视网膜浅层血管网与成年时视网膜浅层血管网设计形态主要分布和血管分支机构分级管理基本情况相同,形成一个成熟的分级血管树。视网膜血管网的分层也逐渐形成。图2显示了啮齿类动物以及视网膜血管网进行分层的形成一个过程。P9的视网膜切片图中只有位于神经节细胞层的浅层血管阿;P14至成年的视网膜切片图中浅层血管网已发出贯穿内网层和内核层的垂直分支并在内核层内.外侧缘形咸平行于浅层血管网的两个深层血管网。在P14至成人的视网膜膜中也可观察到浅层血管网、两层深层血管网以及它们之间的连接分支。由此我们可知.深层血管网是在浅层血管网进行覆盖企业整个视网膜（约P9左右）之后可以形成的,P14时基本没有形成3个平行的血管网系统分层。
1.2啮齿动物视网膜星形胶质细胞和血管网的发育：星形胶质细胞与视网膜血管网的发育密切相关。我们用GFAP抗体进行标记啮齿类动物视网膜星形胶质细胞,发现星形胶质细胞同时也是从视乳头部位可以开始不断生长,连在视网膜内表面现象蔓延生长,最终形成覆盖企业整个研究视网膜。细胞案起相互接触或缝绕形成网状结构和中空管样结构.类似与视网膜上的血管网。图3显示了不同年龄小鼠出生后视网膜星形胶质细胞的分布情况。PI至P3,GFAP阳性肿瘤细胞仅出现在视乳头和邻近周围环境区域,细胞呈细长流线型,多数企业只有通过两个突起,突起发展之间没有形成一个网状或环状联系。P5至P7,GFAP阳性细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现中空“管样”结构.细胞突起数目增多，细胞外形由不典型的星状（有2~3个突起）变成典型的星状外形（有5~了个突起）。从p1o到成年，星形胶质细胞进程的网络发展:从密度更大到更松散，中空的“腔”状结构逐渐发展出分级分支，在视网膜内表面形成血管网络。
1.3成年啮齿类动物BRB的结构:为了学生观察BRB的组成,我们中国用了3种不同的染色研究方法进行显示以及视网膜血管。明胶墨汁灌流法可以将明胶墨汁灌注在血管腔内并黏附在血管内皮上,此法可有效显示血管腔及血管内皮;Ⅳ型胶原蛋白是由血管内皮细胞分泌的基底层的一部分[”1.用Ⅳ型胶原蛋白抗体染色可以有效显示血管的基膜层;GFAP为星形胶质细胞特异性的胶质丝,用CFAP抗体染色可以有效显示星形胶质细胞的形态及其分支的分布。通过三种不同的染色方法，我们发现在光学显微镜下，成年啮齿动物的BRB至少由内皮细胞、基底膜和星形胶质细胞终足三部分组成。与血-脑屏障的内皮组织细胞、基膜、周细胞和星形神经胶质肿瘤细胞终足构成一个类似。
2.电镜下啮齿类动物血视网膜屏障的发育。
不同学生年龄小鼠视网膜电镜标本研究结果分析显示BRB是在星形胶质细胞和血管壁细胞可以相互促进作用中逐步发展形成的:星形胶质细胞先形成一个支架,构成血管壁的内皮功能细胞和周细胞先后进人支架系统内部,内皮细胞结构之间没有形成更加紧密相关连接并分泌基质形成基膜成分,随后星形胶质细胞的突起变薄变扁形成终足包绕血管壁形成具有完整的BRB。
图5显示了出生后不同年龄的小鼠的BRBR的发展情况。PO的小鼠进行视网膜各层之间均未通过观察到毛细血管。至P3,仅在视网膜内表面即神经网络纤维层发现有毛细血管,且这些通过毛细血管的管腔由单层内皮功能细胞可以围绕发展而成,管壁外基膜边界条件模糊且厚度分布不均一,基膜外侧可见我国多个星形胶质肿瘤细胞的终足或突起不完全信息包围,且终足较厚。至P14,在小鼠进行视网膜以及神经网络纤维层,内阿层,内核层及外网层均可通过观察到毛细血管。毛细血管管腔由单层内皮细胞围能,内皮细胞的管腔面有多个微绒毛,内皮细胞之间出现紧密连接,内皮外侧的基膜边界和厚度较P3时清晰和均匀。基底膜外侧被薄的星形胶质细胞终足或突起所包围。至P30时,在视网膜神经纤维层.内网层、内核层和外网层均可观察到毛细血管。此时的毛细血管的管壁完整,内皮细胞管腔面光滑,胞内有少量内吞泡,细胞之间有紧密连接,基底膜厚度均一,基质均匀,内皮细胞外有周细胞,再外侧有星形胶质细胞的薄层终足或突起完全包绕,成熟的BRB形成。
讨论
1.啮齿类动物视网膜组织血管进行系统的发育
大多数非灵长类哺乳动物的视网膜血管发生在出生后。小鼠出生后,从视神经头部企业出现这样一个血管网可以形成以及视网膜血管,新的血管网建设横跨视网膜内表面在神经网络纤维层蔓延,至成年啮齿类动物视网膜血管信息系统能够粗略地分析分为3层:位于神经节细胞内通过表面的浅层血管网,位于中国内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网,主要为视网膜内侧部提供大量氧气和营养需要物质。本实验详细研究了啮齿动物视网膜血管网络的发展过程，发现啮齿动物的视网膜血管网络在出生后由视网膜头部位置发出，在视网膜内表面扩散和生长，形成浅血管网络。出生后10天左右，浅的血管网覆盖了整个视网膜，并开始生长得更深。在此发展过程中,视网膜浅层血管网系统覆盖区域面积由小变大,血管密度由大变小,均一的血管网建设逐渐出现分化出血管主干,多级分支,并能通过区分动.在p14处，内核层的内侧缘和外侧缘形成了深层的维管网。
本实验研究结果分析表明﹐视网膜血管网的发生发展和成熟与视网膜组织细胞的发生与分化在时间和空间上存在具有一致性。放射性同位素标记研究表明,脊椎动物视网膜中最先分化的细胞是在视网膜的中央,而较晚产生的细胞都是在视网膜的周围;最先产生的是神经节细胞,紧接着是水平细题.视锥细胞和无长突细胞,在更晚时期是双极细胞﹑视杆细胞和Muller细胞“一*。视网膜细胞分化成熟的先中心后周边、先浅层后深层的时空顺序与视网膜血管网先中心后周边,先形成浅层血管网（位于神经节细胞层）再形成深层血管网（位于内核层的内侧缘即无长突细胞所处位置和外侧缘即水平细胞所处位置）存在高度的一致性,这说明视网膜细胞的分化成熟可能与视网膜血管网提供的氧气和营养成分有关。此外，发现视网膜深层血管网的形成在PI4附近，与啮齿类动物睁眼时间一致，说明视网膜深层血管网的形成与视功能的成熟有关。
2.啮齿类动物BRB的发育
中枢神经网络系统的血管生长发育发展成熟也包括内皮组织细胞可以形成可通透性屏障,形成血-脑屏障和BRB。在大脑发育的最早阶段，R-12中存在的脑血管中存在蛋白质和大分子物质的障碍。在发育晚期,星形胶质细胞使血-脑屏障进一步成熟,形成由内皮细胞.内皮功能细胞外基膜,星形胶质细胞终足和周细胞结构构成,在血管以及周围环境还有一个神经元和小胶质细胞之间存在的成熟血-脑屏障[“,选择性通透血源性物质文化进入脑组织,在成年学生可以进行阻止低分子量物质需要通过14·15,维持脑的内环境稳定。成熟的BRR由专门的视网膜微血管和周围环绕的肾上腺细胞和动脉胶质细胞的端脚组成。
我们可以采用3种不同的染色研究方法在光学电子显微镜下观察了成年人和啮齿类动物的BRB结构,并系统地用透射进行电镜通过观察了BRB的发生和形成一个过程。研究结果表明,成年脊椎动物的BRB由血管内皮细胞﹑基膜、周细胞和星形胶质细胞突起构成。小血管周围没有小胶质细胞。BRB功能的完整性管理可以同时通过研究以下分析两种主要成分的存在来鉴定,一个是含有少量内吞泡的细胞发展之间是否存在问题紧密连接,另一个是调控离子和代谢产物浓度的构成屏障本身的分子6。本实验中，透射电镜下视网膜血管的超微结构显示，血管内皮细胞与P14内皮细胞管腔表面的少量微绒毛有密切联系，表明内皮细胞的代谢仍然非常活跃，屏障功能仍在进一步发展。P30时内皮细胞光滑，胞质薄，细胞间连接紧密，符合上述第一个条件。另外,观察研究结果分析表明,在血-视网膜屏障作用形成的早期,微血管系统往往由多个星形胶质肿瘤细胞可以伸出一个较短而厚的终足不完全信息包围,且血管基膜基质不均匀,厚度也不均一。晚期，微血管被细长的末端足部紧密包裹，基底膜基质厚度均匀、均匀，形成成熟的BRB。与脾血窦内皮系统细胞发展之间是否存在差异较大间隙和不完整的基膜模式相比,BRB中多层的星形胶质肿瘤细胞终足,基质进行均匀的完整基膜和紧密相关连接的内皮细胞在视网膜内形成了一个天然的屏障,选择针对性地阻断了血中有害化学物质文化进入视网膜以及组织内,有效地可以维持了视网膜内环境的稳定,维持视网膜神经元的功能,在眼睛内的抗感染中起重要影响作用。
研究表明，视网膜血管网络的形成和血视网膜屏障的形成都离不开视网膜星形胶质细胞。星形胶质细胞和视网膜血管系统之间的关系发展已经开始确立-21。事实上，只有血管化视网膜的物种表达视网膜星形胶质细胞，而在这些物种的视网膜中，星形胶质细胞只存在于血管化的区域。我们的观察分析结果也发现,啮齿类动物视网膜上的星形胶质细胞是从视神经头部企业进入视网膜并在视网膜内表面迁移能力形成一个网状网络结构,血管网也从视乳头部位出现问题并在视网膜内表面迁移学习形成网状结构,与上述方法研究调查结果作为基本―致。
综上所述，本实验建立了完整的出生后啮齿动物视网膜血管系统发育模型，进一步提供了小鼠视网膜血管系统发育与视网膜细胞发育和视网膜视功能建立相关的证据。血-视网膜屏障的发育发展成熟使视网膜具备进行一定的抗感染处理能力,维持治疗视网膜内环境的稳定。
